植物组织培养概念（广义）又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织。器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。 植物组织培养概念（狭义）指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。

组织培养推动了植物遗传、生理、生化和病理学的研究, 已成为植物科学研究中的常规方法。 花药和花粉培养获得的单倍体和纯合二倍体植株, 是研究细胞遗传的极好材料。 在细胞培养中很容易引起变异和染色体变化, 从而可得到作物的附加系、代换系和易位系等新类型, 为研究染色工程开辟了新途径。

细胞培养和组织培养为研究植物生理活动提供了一种极有力的手段。 植物组织培养工作曾在矿质营养、有机营养、生长活性物质等方面开展了很多研究, 有益于了解植物的营养问题。 用单细胞培养研究植物的光合代谢是非常理想的, 近年来, 光自养培养研究也是十分有效的。 在细胞的生物合成研究中, 细胞组织培养也极为有用, 如查明了尼古丁在烟草中的部位等。 细胞培养为研究病理学提供了方便, 如植物的抗病性就可以单细胞或原生质体培养进行鉴定, 几天之内就可以得到结果。

理论起源

19世纪30年代，德国植物学家施莱登和德国动物学家施旺创立了细胞学说，根据这一学说，如果给细胞提供和生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活；1902年，德国植物学家哈伯兰特细胞全能性的理论是植物组培的理论基础。

1958年，一个振奋人心的消息从美国传向世界各地，美国植物学家斯蒂瓦特等人，用胡萝卜韧皮部的细胞进行培养，终于得到了完整植株，并且这一植株能够开花结果，证实了哈伯兰特在五十多年前关于细胞全能的预言。植物组培的简单过程如下：剪接植物器官或组织——经过脱分化（也叫去分化）形成愈伤组织——再经过再分化形成组织或器官——经过培养发育成一颗完整的植株。

植物组培的大致过程是：在无菌条件下，将植物器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）的一部分切下来，用纤维素酶与果胶酶处理用以去掉细胞壁，使之露出原生质体，然后放在适当的人工培养基上进行培养，这些器官或组织就会进行细胞分裂，形成新的组织。不过这种组织没有发生分化，只是一团薄壁细胞，叫做愈伤组织。在适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织便开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株。

步骤

培养基配制

配制培养基有两种方法可以选择，一是购买培养基中所有化学药品，按照需要自己配制；二是购买商品的混合好的培养基基本成分粉剂，如MS、B5等。

自己配制可以节约费用，但浪费时间、人力、且有时由于药品的质量问题，给实验带来麻烦。就目前国内的情况看，大部分还是自己配制。为了方便起见，现以MS培养基为例介绍配置培养基的主要过程。

1．配制几种母液

1．配制MS大量元素母液

一般将大量元素分别配制成100倍的母液，使用时再分别稀释100倍。

分别称取

NH4NO3 165g KH2PO4 17g

KNO3 190g CaCl2·2H2O 44g

MgSO4·7H2O 37g

各自配成1L的母液。倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

2．配制MS微量元素母液

一般将微量元素配制成100倍母液。

依次称取

KI 0.083g Na2MoO4·2H2O 0.025g

H3BO3 0.62g CuSO4·5H2O 0.0025g

MnSO4·H2O 1.69g CoCl2·6H2O0 .0025g

ZnSO4·7H2O 0.86g

配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O 由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，可先配成调整液。

分别称取

CuSO4·5H2O 0.05g CoCl2·6H2O 0.05g

各自配成100ml的调整液，然后取5ml就还有0。0025g的量。

3．配制MS有机母液

一般配制成100倍MS有机母液。

依次称取

肌醇 10g 盐酸硫胺素（VB1）0 .01g

烟酸 0.05g 甘氨酸 0.2g

盐酸吡哆醇（VB6） 0.05g

配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

4．配制MS铁盐母液

一般配制成100倍MS铁盐母液。

依次称取

EDTA二钠3.73g FeSO4·7H2O2.78g

配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

所以MS母液有5种大量元素母液，加上MS微量元素母液、MS有机母液和MS铁盐母液，共8种母液。

激素母液的配制

各种生长素和细胞分裂素要单独配制，不能混合在一起，生长素类一般要先用少量95%的酒精或1当量的NaOH溶解，细胞分裂素一般要先用1当量的盐酸溶解，然后再加蒸馏水定容。一般取100mg配成100ml母液。

2．配制培养基

以配置1L MS培养基为例，按顺序进行如下操作：

1．先在烧杯中放入一些蒸馏水。

2．分别取上面八种母液10ml倒入。

3．一般称取30g蔗糖倒入，搅拌溶解。

4．加蒸馏水用量筒定溶至1L。

5．按设计好的方案添加各种激素，由于激素的用量很小，而且激素对组培植物的生长至关重要。所以有条件的话最好用微量可调移液器吸取，减少误差。

6．用精密试纸或酸度计调整PH至5.7～5.8。（有条件的话使用酸度计，比较精确） 可配1当量的HCL和1当量的NaOH用来调溶液PH值。

1当量HCL配制：用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。

1当量NaOH配制：称取NaOH 4g 配成100ml溶液。

7．称取5g左右琼脂粉（质量好的琼脂粉),倒入上面配好的溶液中，放在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉熔化。

8．稍微冷却后，分装入培养容器中。无盖的培养容器要用封口膜或牛皮纸封口，用橡皮筋或绳子扎紧。

9．放入消毒灭菌锅灭菌，灭菌20分钟左右。

10．灭菌后从灭菌锅中取出培养基，平放在实验台上令其冷却凝固。

灭菌

灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者要清楚有菌和无菌的范畴。有菌的范畴是：凡是暴露在空气中的物体，接触自然水源的物体，至少它的表面都是有菌的。依此观点，无菌室等未处理的地方、超净台的表面、简单煮沸的培养基、我们使用的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表及与外界相连的内表，如整个消化道、呼吸道，即我们呼出的气体、培养容器无论洗得多干净等等都是有菌的。

这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。菌的特点是：极小，肉眼看不见。无处不在，无时不有，无孔不入。在自然条件下忍耐力强，生活条件要求简单，繁殖力极强，条件适宜时便可大量滋生。

无菌的范畴是：经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其他物理或化学的灭菌方法处理后的物体（当然这些方法必须已经证明是有效的），高层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部，强酸强碱，化学元素灭菌剂等表面和内部都是无菌的。从以上可以看出：在地球表面无菌世界要比有菌世界小的多。

灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。与此相关的一个概念是消毒，它指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用，显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌厚垣孢子等不会完全杀死，即由于在消毒后的环境里和物品上还有活着的微生物，所以通过严格灭菌的操作空间（接种、超净台等）和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行的操作，就叫做无菌操作。

植物组织培养对无菌条件的要求是非常严格的，甚至超过微生物的培养要求，这是因为培养基含有丰富的营养，稍不小心就引起杂菌污染。要达到彻底灭菌的目的，必须根据不同的对象采取不同的切实有效的方法灭菌，才能保证培养时不受杂菌的影响，使试管苗能正常生长。

常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即：物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高压蒸煮）、射线处理（紫外线、超声波、微波）、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏水、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。

1．培养基用湿热灭菌

培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。

注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。

关阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.1～0.15MPa，20分钟。

按容器大小不同，保压时间有所不同，见表。该表所列数字是彻底灭菌很保险的数字，如果容器体积较大，但是放置的数量很少，也可以减少时间。

接种

接种时由于有一个敞口的过程，所以是极易引起污染的时期，这一时期主要由空气中的细菌和工作人员本身引起，接种室要严格进行空间消毒。接种室内保持定期用1%～3%的高锰酸钾溶液对设备、墙壁、地板等进行搽洗。除了使用前用紫外线和甲醛灭菌外，还可在使用期间用70%的酒精或3%的来苏儿喷雾，使空气中灰尘颗粒沉降下来。无菌操作可按以下步骤进行：

1．在接种4小时前用甲醛熏蒸接种室，并打开其内紫外线灯进行杀菌；

2．在接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯；

3．接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等；

4．上工作台后，用酒精棉球搽拭双手，特别是指甲处。然后搽拭工作台面；

5．先用酒精棉球搽拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；

6．接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；

7．接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外线灯灭菌30分钟，若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。

接种是将已消毒好的根、茎、叶等离体器官，经切割或剪裁成小段或小块，放入培养基的过程。现将接种前后的程序连贯地介绍。

无菌接种步骤：

1．将初步洗涤及切割的材料放入烧杯，带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗，最后沥去水分，取出放置在灭过菌的纱布上或滤纸上。

2．材料吸干后，一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割。如叶片切成0。5cm平方的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含1～2片幼叶的茎尖大小等。在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。

3．用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。具体操作过程（以试管为例）是：先解开包口纸，将试管几乎水平拿着，使试管口靠近酒精灯火焰，并将管口在火焰上方转动，使管口里外灼烧数秒钟。

若用棉塞盖口，可先在管口外面灼烧，去掉棉塞，再烧管口里面。然后用镊子夹取一块切好的外植体送入试管内，轻轻插入培养基上。若是叶片直接附在培养基上，以放1～3块为宜。至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放（尖端向上）外，其他尚无统一要求。接种完后，将管口在火焰上再灼烧数秒种。并用棉塞，塞好后，包上包口纸，包口纸里面也要过火。

培养

培养指把培养材料放在培养室（无光、适宜温度、无菌）里，使之生长，分裂和分化形成愈伤组织，光照条件下进一步分化成再生植株的过程。

1．培养方法

1．固体培养法

即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。是现在最常用的方法。虽然该方法设备简单，易行，但养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中毒现象发生。

2．液体培养法

即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。由于液体中氧气含量较少，所以通常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给，采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养，其速度一般为50～100r/min，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。

2．培养步骤

1．初代培养

初代培养旨在获得无菌材料和无性繁殖系。即接种某些外植体后，最初的几代培养。初代培养时，常用诱导或分化培养基，即培养基中含有较多的细胞分裂素和少量的生长素。初代培养建立的无性繁殖系包括：茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。根据初代培养时发育的方向可分为：

1）顶芽和腋芽的发育

采用外源的细胞分裂素，可促进使具有顶芽或没有腋芽的休眠侧芽启动生长，从而形成一个微型的多枝多芽的小灌木丛状的结构。在几个月内可以将这种丛生苗的一个枝条转接继代，重复芽苗增殖的培养，并且迅速获得多数的嫩茎。然后将一部分嫩茎转移到生根培养基上，就能得到可种植到土壤中去的完整小植株。

一些木本植物和少数草本植物也可以通过这种方式来进行再生繁殖，如月季、茶花、菊花、香石竹等等。这种繁殖方式也称作微型繁殖，它不经过发生愈伤组织而再生，所以是最能使无性系后代保持原品种的一种繁殖方式。

适宜这种再生繁殖的植物，在采样时，只能采用顶芽、侧芽或带有芽的茎切段，其他如种子萌发后取枝条也可以。

茎尖培养可看作是这方面较为特殊的一种方式。它采用极其幼嫩的顶芽的茎尖分生组织作为外植体进行接种。在实际操作中，采用包括茎尖分生组织在内的一些组织来培养，这样便保证了操作方便以及容易成活。

用靠培养定芽得到的培养物一般是茎节较长，有直立向上的茎梢，扩繁时主要用切割茎段法，如香石竹、矮牵牛、菊花等。但特殊情况下也会生出不定芽，形成芽丛。

2）不定芽的发育

在培养中由外植体产生不定芽，通常首先要经脱分化过程，形成愈伤组织的细胞。然后，经再分化，即由这些分生组织形成器官原基，它在构成器官的纵轴上表现出单向的极性（这与胚状体不同）。多数情况下它形成芽，后形成根。

另一种方式是从器官中直接产生不定芽，有些植物具有从各个器官上长出不定芽的能力如矮牵牛、福禄考、悬钩子等。当在试管培养的条件下，培养基中提供了营养，特别是提供了连续不断植物激素的供应，使植物形成不定芽的能力被大大地激发起来。许多种类的外植体表面几乎全部为不定芽所复盖。

在许多常规方法中不能无性繁殖的种类，在试管条件下却能较容易地产生不定芽而再生，如柏科，松科，银杏等一些植物。许多单子叶植物储藏器官能强烈地发生不定芽，用百合鳞片的切块就可大量形成不定鳞茎。

在不定芽培养时，也常用诱导或分化培养基。用靠培养不定芽得到的培养物，一般采用芽丛进行繁殖，如非洲菊、草莓等。

3）体细胞胚状体的发生与发育

体细胞胚状体类似于合子胚但又有所不同，它也通过球形，心形，鱼雷形和子叶形的胚胎发育时期，最终发育成小苗。但它是由体细胞发生的。胚状体可以从愈伤组织表面产生，也可从外植体表面已分化的细胞中产生，或从悬浮培养的细胞中产生。

4）初代培养外植体的褐变

外植体褐变是指在接种后，其表面开始褐变，有时甚至会使整个培养基褐变的现象。它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发生变化所致。在褐变过程中，会产生醌类物质，它们多呈棕褐色，当扩散到培养基后，就会抑制其他酶的活性，从而影响所接触外植体的培养。

褐变的主要原因如下：

a、植物品种 研究表明，在不同品种间的褐变现象是不同的。由于多酚氧化酶活性上的差异，因此，有些花卉品种的外植体在接种后较容易褐变，而有些花卉品种的外植体在接种后不容易褐变。因此，在培养过程中应该有所选择，对不同的品种分别进行处理。

b、生理状态由于外植体的生理状态不同，所以在接种后褐变程度也有所不同。一般说来，处于幼龄期的植物材料褐变程度较浅，而从已经成年的植株采收的外植体，由于含醌类物质较多，因此褐变较为严重。一般来说，幼嫩的组织在接种后褐变程度并不明显，而老熟的组织在接种后褐变程度较为严重。

c、培养基成分 浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加，此外，细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。

d、培养条件不当 如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。

为了提高组织培养的成苗率，必须对外植体的褐变现象加以控制。可以采用以下措施防止、减轻褐变现象的发生。

1．选择合适的外植体 一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。

2．合适的培养条件 无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。

3．使用抗氧化剂 在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。另外，使用0.1%～0.5%的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。

4．连续转移 对容易褐变的材料可间隔2～24小时的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理7～10天后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。

(2)继代培养

在初代培养的基础上所获得的芽、苗、胚状体和原球茎等，数量都还不够，它们需要进一步增殖，使之越来越多，从而发挥快速繁殖的优势。

继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁殖培养过程。旨在繁殖出相当数量的无根苗，最后能达到边繁殖边生根的目的。继代培养的后代是按几何级数增加的过程。如果以2株苗为基础，那么经10代将生成210株苗。

继代培养中扩繁的方法包括：切割茎段、分离芽丛、分离胚状体、分离原球茎等。切割茎段常用于有伸长的茎梢、茎节较明显的培养物。这种方法简便易行，能保持母种特性。培养基常是MS基本培养基；分离芽丛适于由愈伤组织生出的芽丛。培养基常是分化培养基。若芽丛的芽较小。可先切成芽丛小块，放入MS培养基中，待到稍大时，再分离开来继续培养。

增殖使用的培养基对于一种植物来说每次几乎完全相同，由于培养物在接近最良好的环境条件，营养供应和激素调控下，排除了其他生物的竞争，所以能够按几何级数增殖。

在快速繁殖中初代培养只是一个必经的过程，而继代培养则是经常性不停的进行过程。但在达到相当数量之后，则应考虑使其中一部分转入生根阶段。从某种意义上讲，增殖只是储备母株，而生根才是增殖材料的分流，生产出成品。

3．继代培养时材料的玻璃化

实践表明，当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水迹状，这种现象通常称为玻璃化。它的出现会使试管苗生长缓慢、繁殖系数有所下降。玻璃化为试管苗的生理失调症。

因为出现玻璃化的嫩茎不宜诱导生根，因此，使繁殖系数大为降低。在不同的种类、品种间，试管苗的玻璃化程度也有所差异。当培养基上细胞分裂素水平较高时，也容易出现玻璃化现象。在培养基中添加少量聚乙烯醇、脱落酸等物质，能够在一定程度上减轻玻璃化的现象发生。

呈现玻璃化的试管苗，其茎、叶表面无蜡质，体内的极性化合物水平较高，细胞持水力差，植株蒸腾作用强，无法进行正常移栽。这种情况主要是由于培养容器中空气湿度过高，透气性较差造成的，其具体解决的方法为：

a、增加培养基中的 溶质水平，以降低培养基的水势；

b、减少培养基中含氮化合物的用量；

c、增加光照

d、增加容器通风，最好进行CO2施肥，这对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用；

e、降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻试管苗玻璃化现象发生；

f、降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加入适量脱落酸。

3．生根培养

当材料增殖到一定数量后，就要使部分培养物分流到生根培养阶段。若不能及时将培养物转到生根培养基上去，就会使久不转移的苗子发黄老化，或因过分拥挤而使无效苗增多造成抛弃浪费。根培养是使无根苗生根的过程，这个过程目的是使生出的不定根浓密而粗壮。生根培养可采用1/2或者1/4MS培养基，全部去掉细胞分裂素，并加入适量的生长素（NAA、IBA等）。

诱导生根可以采用下列方法

a、将新梢基部浸入50或100*10-6IBA溶液中处理4～8小时；

b、在含有生长素的培养基中培养4～6天

c、直接移入含有生长素的生根培养基中。

上述三种方法均能诱导新梢生根，但前两种方法对新生根的生长发育则更为有利。而第三种对幼根的生长有抑制作用。其原因是当根原始体形成后较高浓度生长素的继续存在，则不利于幼根的生长发育。不过这种方法比较可行。

另外也可采用下列方法就可生根。1、延长在增殖培养基中的培养时间；2、有意降低一些增殖倍率，减少细胞分裂素的用量（即将增殖与生根合并为一步）；3、切割粗壮的嫩枝在营养钵中直接生根，此方法则没有生根阶段。可以省去一次培养基制作，切割下的插穗可用生长素溶液浸蘸处理，但这种方法只适于一些容易生根的作物。

另外少数植物生根比较困难时，则需要在培养基中放置滤纸桥，使其略高于液面，靠滤纸的吸水性供应水和营养，从而诱发生根。

从胚状体发育成的小苗，常常有原先已分化的根，这种根可以不经诱导生根阶段而生长。但因经胚状体发育的苗数特别多，并且个体较小，所以也常需要一个低浓度或没有植物激素的培养基培养的阶段，以便壮苗生根。

试管内生根壮苗的阶段，为了成功地将移植到试管外的环境中，以使试管苗适应外界的环境条件。通常不同植物的适宜驯化温度不同。如菊花，以18～20℃为宜。实践证明植物生长的温度过高不但会牵涉到蒸腾加强。而且还牵涉到菌类易滋生的问题。温度过低使幼苗生长迟缓，或不易成活。春季低温时苗床可加设电热线，使基质温度略高于气温2～3℃，这不但有利于生根和促进根系发达，而且有利于提前成活。

移植到试管外的植物苗光强度应比移植前培养有所提高，并可适应强度较高的漫射光，（约4000lx左右），以维持光合作用所需光照强度。但光线过强刺激蒸腾加强，会使水分平衡的矛盾更尖锐。

驯化移栽

试管苗移栽是组织培养过程的重要环节，这个工作环节做不好，就会造成前功尽弃。为了做好试管苗的移栽，应该选择合适的基质，并配合以相应的管理措施，才能确保整个组织培养工作的顺利完成。

试管苗由于是在无菌、有营养供给、适宜光照和温度近100%的相对湿度环境条件下生长的，因此，在生理、形态等方面都与自然条件生长的小苗有着很大的差异。所以必须通过炼苗，例如通过控水、减肥、增光、降温等措施，使她们逐渐地适应外界环境，从而使生理、形态、组织上发生相应的变化，使之更适合于自然环境，只有这样才能保证试管苗顺利移栽成功。

从叶片上看，试管苗的角质层不发达，叶片通常没有表皮毛，或仅有较少表皮毛，甚至叶片上出现了大量的水孔，而且，气孔的数量、大小也往往超过普通苗。由此可知，试管苗更适合于高湿的环境生长，当将它们移栽到试管外环境时，试管苗失水率会很高，非常容易死亡。

因此，为了改善试管苗的上述不良生理、形态特点，则必须经过与外界相适应的驯化处理，通常采取的措施有：对外界要增加湿度、减弱光照；对试管内要通透气体、增施二氧化碳肥料、逐步降低空气湿度等。

另外，对栽培驯化基质要进行灭菌是因为试管苗在无菌的环境中生长，对外界细菌、真菌的抵御能力极差。为了提高其成活率，在培养基质中可掺入75%的百菌清可湿性粉剂200～500倍液，以进行灭菌处理。

1．移栽用基质和容器

适合于栽种试管苗的基质要具备透气性、保湿性和一定的肥力，容易灭菌处理，并不利于杂菌滋生的特点，一般可选用珍珠岩、蛭石、砂子等。为了增加粘着力和一定的肥力可配合草炭土或腐殖土。配时需按比例搭配，一般用珍珠岩、蛭石、草炭土或腐殖土比例为1：1：0.5。也可用砂子：草炭土或腐殖土为1：1。

这些介质在使用前应高压灭菌。或用至少小时烘烤来消灭其中的微生物。要根据不同植物的栽培习性来进行配制，这样才能获得满意的栽培效果。以下介绍几种常见的试管苗栽培基质。

1．河砂

河砂分为粗砂、细砂两种类型。粗砂即平常所说的河砂，其颗粒直径为1～2mm。细砂即通常所说的面砂，其颗粒直径为0.1～0.2nm。河砂的特点是排水性强，但保水蓄肥能力较差，一般不单独用来直接栽种试管苗。

2．草炭土

草炭土是由沉积在沼泽中的植物残骸经过长时间的腐烂所形成，其保水性好，蓄肥能力强，呈中性或微酸性反应，但通常不能单独用来栽种试管苗，宜与河砂等种类相互混合配成盆土而加以使用。

3．腐殖土

腐殖土是由植物落叶经腐烂所形成。一种是自然形成，一种是人为造成，人工制造时可将秋季的落叶收集起来，然后埋入坑中，灌水保湿的条件下使其风化，然后过筛即可获得。腐叶上含有大量的矿质营养、有机物质，它通常不能单独使用。掺有腐殖土的栽培基质有助于植株发根。

4．容器

栽培容器可用6×6cm～10×10cm的软塑料钵，也可用育苗盘。前者占地大，耗用大量基质，但幼苗不用移栽，后者需要二次移苗，但省空间、省基质。

2．移栽前的准备

移栽前可将培养物不开口移到自然光照下锻炼2-3天，让试管苗接受强光的照射，使其长得壮实起来，然后再开口练苗1-2天，经受较低湿度的处理，以适应将来自然湿度的条件。

3．移栽和幼苗的管理

从试管中取出发根的小苗，用自来水洗掉根部粘着的培养基，要全部除去，以防残留培养基滋生杂菌。但要轻轻除去，应避免造成伤根。移植时用一个筷子粗的竹签在基质中插一小孔，然后将小苗插入，注意幼苗较嫩，防止弄伤，栽后把苗周围基质压实，栽前基质要浇透水。栽后轻浇薄水。再将苗移入高湿度的环境中。保证空气湿度达90%以上。

1．保持小苗的水分供需平衡。在移栽后5～7天内，应给予较高的空气湿度条件，使叶面的水分蒸发减少，尽量接近培养瓶的条件，让小苗始终保持挺拔的状态。保持小苗水分供需平衡首先营养钵的培养基质要浇透水，所放置的床面也要浇湿，然后搭设小拱棚，以减少水分的饿蒸发，并且初期要常喷雾处理，保持拱棚薄膜上有水珠出现。

当5～7天后，发现小苗有生长趋势，可逐渐降低湿度，减少喷水次数，将拱棚两端打开通风，使小苗适应湿度较小的条件。约15天以后揭去拱棚的薄膜，并给予水分控制，逐渐减少浇水，促进小苗长得粗壮。

2．防止菌类滋生。由于试管苗原来的环境是无菌的，移出来以后难以保持完全无菌，因此，应尽量不使菌类大量滋生，以利成活。所以应对基质进行高压灭菌或鸿烤灭菌。可以适当使用一定浓度的杀菌剂以便有效的保护幼苗，如多菌灵、托布津，浓度800～1000倍，喷药宜7～10天一次。在移苗时尽量少伤苗，伤口过多，根损伤过多，都是造成死苗的原因。喷水时可加入0。1%的尿素，或用1/2MS大量元素的水溶液作追肥，可加快苗的生长与成活。

3．一定的温、光条件。试管苗移栽以后要保持一定的温光条件，适宜的生根温度是18～20℃，冬春季地温较低时，可用电热线来加温。温度过低会使幼苗生长迟缓，或不易成活。温度过高会使水分蒸发，从而使水分平衡受到破坏，并会促使菌类滋生。

另外在光照管理的初期可用较弱的光照，如在小拱棚上加盖遮阳网或报纸等，以防阳光灼伤小苗和增加水分的蒸发。当小植株有了新的生长时，逐渐加强光照，后期可直接利用自然光照。促进光合产物的积累，增强抗性，促其成活。

4．保持基质适当的通气性。要选择适当的颗粒状基质，保证良好的通气作用。在管理过程中不要浇水过多，过多的水应迅速沥除，以利根系呼吸。

综上所述，试管苗在移栽的过程中，只要把水分平衡、适宜的介质、控制杂菌和适宜的光、温条件控制好，试管苗是很容易移栽的。

优点

可以在不受植物体其它部分干扰下研究被培养部分的生长和分化的规律，并且可以利用各种培养条件影响它们的生长和分化，以解决理论上和生产上的问题。

有力地推动了生物科学中植物生理学、生物化学、遗传学、细胞学、形态学以及农、林、医、药等各门学科的发展和相互渗透，促进了营养生理、细胞生理和代谢、生物合成、基因转移、基因重组的研究。

当前组织培养作为生物工程的一项重要技术，在基础理论研究和生产实践中发挥的作用与日俱增，可望为造福人类作出贡献。

植物组织培养应用

自哈布兰特( G。 Haberlandt ) 提出细胞全能性理论在无数科学家的努力下以及进行离体培养以来, 经过80多年的历程,才使这项技术趋于完善,趋于成熟。近40 年来,植物组织培养技术得到了迅速发展,已渗透到植物生理学、病理学、药学、遗传学、育种以及生物化学等各个研究领域, 成为生物学科中的重要研究技术和手段之一。 并广泛应用于农业、林业、工业、医药业等多种行业, 产生了巨大的经济效益和社会效益, 已成为当代生物科学中最有生命力的一门学科。

基本概念

植物组织培养是指在无菌条件下, 将离体的植物器官( 如根尖、茎尖、叶、花、未成熟的果实、种子等)、组织( 如形成层、花药组织、胚乳、皮层等)、细胞( 如体细胞、生殖细胞等)、胚胎( 如成熟和未成熟的胚)、原生质体( 如脱壁后仍具有生活力的原生质体),培养在人工配制的培养基上, 给予适宜的培养条件, 诱发产生愈伤组织, 或潜伏芽等, 或长成完整的植株, 统称为植物组织培养。

由于是在试管内培养, 而且培养的是脱离植株母体的培养物, 因此也称离体培养或试管培养。 根据外植体来源和培养对象的不同, 又分为植株培养、胚胎培养、器官培养、组织培养、原生质体培养等。

应用现状

2.1在植物育种上的应用

目前, 国内外把植物组织培养已普遍应用于作物育种, 并在以下几个方面取得了较大进展:

( 1) 单倍体育种 单倍体植株往往不能结实, 在培养中用秋水仙素处理, 可使染色体加倍, 成为纯合二倍体植株, 这种培养技术在育种上的应用称为单倍体育种。 单倍体育种具有高速、高效率、基因型一次纯合等优点, 因此, 通过花药或花粉培养的单倍体育种, 已经作为一种崭新的育种手段问世, 并已开始育成大面积种植的作物新品种。

在单倍体育种方面, 我国科学家做出了突出贡献。 1974 年就育成了世界上第一个作物新品种——单育1 号烟草品种。 随后又育成了中花8号水稻和京花1号、京单92 – 2097 小麦等面积栽培的作物新品种, 还获得了多种作物的大量花培新品系。 河南省在花培育种方面卓有成效, 培育出了花培28、花配2321、峡麦1号、豫麦37号、花9、花特早、豫麦60 号等优良品种( 系) , 已累计推广700 多万亩,在全国名列前茅。

( 2) 胚胎培养 在植物种间杂交或远缘杂交中, 杂交不孕给远缘杂交带来了许多困难。 而采用胚的早期离体培养可以使胚正常发育并成功地培养出杂交后代, 可以通过无性系繁殖获得数量较多、性状一致的群体, 胚培养已在50多个科属中获得成功。 远缘杂交中, 可把未受精的胚珠分离出来, 在试管内用异种花

粉在胚珠上萌发受精, 产生的杂种胚在试管中发育成完整植株, 此法称为“试管受精”。用胚乳培养可以获得三倍体植株, 为诱导形成三倍体植物开辟了一条新途径。 三倍体加倍后可得到六倍体, 可育成多倍体新品种。

( 3) 细胞融合 通过原生质体融合, 可部分克服有性杂交不亲和性, 而获得体细胞杂种, 从而创造新种或育成优良品种, 这是组织培养应用最诱人的一个方面。 目前已获得40 余个种间、属间、甚至科间的体细胞杂种、愈伤组织, 有些还进而分化成苗。

目前, 采用原生质体融合技术已经能从不杂交的植物中如番茄和马铃薯、烟草和龙葵、芥菜和油菜等获得属间杂种, 但这些杂种尚无实际应用价值。 随着原生质体融合、选择、培养技术的不断成熟和发展, 今后可望获得更多有一定应用价值的经济作物体细胞杂种及新品种。

( 4) 基因工程 用基因工程的方法, 把目标基因切割下来并通过载体使外来基因整合进植物的基因组是完全有可能的, 这项研究如果获得成功, 将克服作物育种中的盲目性, 而变成按人们的需要操纵作物的遗传变异, 育成优良品种。 目前这项研究刚刚起步, 加上植物的遗传背景比原核生物更为复杂, 因此, 要

用基因工程实现作物改良, 以增加产量和改善品质, 将是21 世纪需要解决一个问题。

( 5) 培养细胞突变体 无论是愈伤组织培养还是细胞培养, 培养细胞均处在不断分生状态, 容易受培养条件和外界压力( 如射线、化学物质等) 的影响而产生诱变, 从中可以筛选出对人们有用的突变体, 从而育成新品种。 尤其对原来诱发突变较为困难、突变率较低的一些性状, 用细胞培养进行诱发、筛选和鉴定

时, 处理细胞数远远多于处理个体数, 因此一些突变率极低的性状有可能从中选择出来。 例如植物抗病虫性、抗寒、耐盐、抗除草剂毒性、生理生化变异株等的诱发, 为进一步筛选和选育提供了丰富的变异材料。 目前, 用这种方法已筛选到抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白、矮秆高产的突变体, 有些已用于生产。

2. 2在植物脱毒和快速繁殖上的应用

植物脱毒和离体快速繁殖是目前植物组织培养应用最多、最有效的一个方面。 很多农用物都带有病毒, 特别是无性繁殖植物, 如马铃薯、甘薯、草莓、大蒜等。 但是, 感病植株并非每个部位都带有病毒, White早在1943 年就发现植物生长点附近的病毒浓度很低甚至无病毒。 如果利用组织培养方法, 取一定大小的茎尖进行培养, 再生的植株有可能不带病毒, 从而获得脱病毒苗, 再用脱毒苗进行繁殖, 则种植的作物就不会或极少发生病毒。

目前组织培养在甘蔗、菠萝、香蕉、草莓等主要经济作物上已成功应用。 取用的外植体已不仅限茎尖, 其他如侧芽、鳞片、叶片、球茎、根等都可以应用。由于组织培养法繁殖作物的突出特点是快速, 因此, 对一些繁殖系数低、不能用种子繁殖的“名、优、特、新、奇”作物品种的繁殖, 意义更大。

对于脱毒苗、新育成、新引进、稀缺育种、优良单株、濒危植物和基因工程植株等可通过离体快速繁殖, 同时可不受地区、气候的影响, 比常规方法快数万倍到数百万倍的速度扩大繁殖, 及时提供大量优质种薯和种苗。 马铃薯茎类脱毒、无毒种苗和微型脱毒种薯已在马铃薯生产上广泛应用, 从根本上解决了马铃薯的退化问题。 目前, 观赏植物、园艺作物、经济林木、无性繁殖作物等部分或大部分都用离体快繁提供苗木, 试管苗已出现在国际市场上并形成产业化。

2.3在植物有用产物生产上的应用

利用组织或细胞的大规模培养, 有可能生产出人类所需要的一切天然有机化合物, 如蛋白质、脂肪、糖类、药物、香料、生物缄及其他活性化合物。 因此, 近年来这一领域已引起人们的极大兴趣, 许多产业部门纷纷投资进行研究。 目前, 大约已有20 多种植物的培养组织中有效物质高于原植物, 国际上已获得这方面专利100 多项。

近年来, 用单细胞培养生产蛋白质, 将给饲料和食品工业提供广阔的原料生产前途; 用组织培养方法生产微生物以及人工不能合成的药物或有效成分的研究, 正在不断深入, 有些已投入工业化生产,预计今后将有更大发展。

2.4在植物种质资源保存和交换上的应用

农业生产是在现有种质资源的基础上进行的, 由于自然灾害和生物之间的竞争以及人类活动对大自然的影响, 已有相当数量的植物物种在地球上消失或正在消失。 具有独特遗传性状的生物物种的绝迹是一种不可挽回的损失。 利用植物组织和细胞法低温保存种质, 可大大节约人力、物力和土地, 同时也便于种质

资源的交换和转移, 防止有害病虫的人为传播, 给保存和抢救有用基因带来了希望。 例如胡萝卜和烟草等植物的细胞悬浮物, 在- 20℃至-196℃ 的低温下贮藏数月, 尚能恢复生长, 再生成植株。

2.5在遗传、生理、生化和病理研究上的应用

组织培养推动了植物遗传、生理、生化和病理学的研究, 已成为植物科学研究中的常规方法。 花药和花粉培养获得的单倍体和纯合二倍体植株, 是研究细胞遗传的极好材料。 在细胞培养中很容易引起变异和染色体变化, 从而可得到作物的附加系、代换系和易位系等新类型, 为研究染色工程开辟了新途径。

细胞培养和组织培养为研究植物生理活动提供了一种极有力的手段。 植物组织培养工作曾在矿质营养、有机营养、生长活性物质等方面开展了很多研究, 有益于了解植物的营养问题。 用单细胞培养研究植物的光合代谢是非常理想的, 近年来, 光自养培养研究也是十分有效的。

在细胞的生物合成研究中, 细胞组织培养也极为有用, 如查明了尼古丁在烟草中的部位等。 细胞培养为研究病理学提供了方便, 如植物的抗病性就可以单细胞或原生质体培养进行鉴定, 几天之内就可以得到结果。

2. 6开放式组织培养技术研究破解世界性难题

以一次性塑料饮水杯和食品保鲜膜作为培养容器和封口材料，添加抑菌剂抑制培养基污染，在自然光的温室里就可以快速繁育出合格、健壮的植物组培苗。该课题日前在北京通过了由我国著名工程院资深院士陈俊愉等9位专家学者的鉴定审核。

专家认为，此项研究针对植物组织培养必须在严格的无菌环境下操作的限制，研制出了高效抑菌剂，抑菌剂加入培养基后，使培养基具有了抑制真菌和细菌生长的功能，并在有限抑菌浓度范围内，对植物生长无不良影响。

因此，在植物组织培养过程中，可以省去培养基高压灭菌程序，不需应用超净工作台即可接种，这在植物组织培养技术史上是一项重大突破，在国内外尚属首创；由普通的聚乙烯塑料水杯代替传统的耐高温高压的玻璃和聚丙烯塑料制品、由食品保鲜膜代替封口膜这项技术也是国内外首例。

该研究所提出的完善的植物开放式组织培养规程，开发的中药抑菌剂生产性商品培养基，大幅度降低了植物组织培养的成本，使植物组织培养这个高精技术走向了普通大众，必将加快我国组织培养产业化发展步伐，推动组培事业的发展。