抗体（antibody），是一种由浆细胞（效应B细胞）分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质，仅被发现存在于脊椎动物的血液等体液中，及其B细胞的细胞膜表面。抗体能识别特定外来物的一个独特特征，该外来目标被称为抗原。

结构

抗体是具有4条多肽链的对称结构，其中2条较长、相对分子量较大的相同的重链（H链）；2条较短、相对分子量较小的相同的轻链（L链）。链间由二硫键和非共价键联结形成一个由4条多肽链构成的单体分子。轻链有κ和λ两种，重链有μ、δ、γ、ε和α五种。

 整个抗体分子可分为恒定区和可变区两部分。在给定的物种中，不同抗体分子的恒定区都具有相同的或几乎相同的氨基酸序列。可变区位于"Y"的两臂末端。在可变区内有一小部分氨基酸残基变化特别强烈，这些氨基酸的残基组成和排列顺序更易发生变异区域称高变区。高变区位于分子表面，最多由17个氨基酸残基构成，少则只有2 —— 3个。高变区氨基酸序列决定了该抗体结合抗原抗原的特异性。一个抗体分子上的两个抗原结合部位是相同的，位于两臂末端称抗原结合片段（antigen-binding fragment, Fab）。"Y"的柄部称结晶片段（crystalline fragment,FC），糖结合在FC 上。

荧光抗体的鉴定

荧光抗体在使用前应加以鉴定。鉴定指医学教丨育网整理标记包括效价及荧光素与蛋白质的结合比率。抗体效价可以用琼脂双扩散法进行滴定，效价大于1：16者较为理想。荧光素与蛋白质结合比率（F/P）的测定和计算的基本方法是：将制备的荧光抗体稀释至A2801≈1.0，分别测读A280 （蛋白质特异吸收峰）和标记荧光素的特异吸收峰，按公式计算。F/P值越高，说明抗体分子上结合的荧光素越多，反之则越少。一般用于固定标本的荧光抗体以F/P=1.5为宜，用于活细胞染色的以F/P=2.4为宜。抗体工作浓度的确定方法类似ELISA间接法中酶标抗体的滴定。将荧光抗体自1：4——1：256倍比稀释，对切片标本作荧光抗体染色。以能清晰显示特异荧光、且非特异染色弱的最高稀释度为荧光抗体工作浓度。荧光抗体的保存应注意防止抗体失活和防止荧光猝灭。最好小量分装，-20℃冻存，这样就可放置3——4年。在4℃中一般也可存放1——2年。

分类

按作用对象

按作用对象，可将其分为抗毒素、抗菌抗体、抗病毒抗体和亲细胞抗体（能与细胞结合的免疫球蛋白，如1型变态反应中的lgE反应素抗体，能吸附在靶细胞膜上）。

按理化性质和生物学功能

按理化性质和生物学功能，可将其分为IgM、IgG、IgA、IgE、IgD五类。

IgM抗体是免疫应答中首先分泌的抗体。它们在与抗原结合后启动补体的级联反应。它们还把入侵者相互连接起来，聚成一堆便于巨噬细胞的吞噬；

IgG抗体激活补体，中和多种毒素。IgG持续的时间长，是唯一能在母亲妊娠期穿过胎盘保护胎儿的抗体。他们还从乳腺分泌进入初乳，使新生儿得到保护；

IgA抗体进入身体的黏膜表面，包括呼吸、消化、生殖等管道的黏膜，中和感染因子。还可以通过母乳的初乳把这种抗体输送到新生儿的消化道黏膜中，是在母乳中含量最多，最为重要的一类抗体；

IgE抗体的尾部与嗜碱细胞、肥大细胞的细胞膜结合。当抗体与抗原结合后，嗜碱细胞与肥大细胞释放组织胺一类物质促进炎症的发展。这也是引发速发型过敏反应的抗体；

IgD抗体的作用还不太清楚。它们主要出现在成熟的B淋巴细胞表面上，可能与B细胞的分化有关。（IgD于1995年从人骨髓瘤蛋白中发现，分子量为175kD，主要由扁桃体、脾等处浆细胞产生，人血清中IgD浓度为3——40μg/ml,不到血清总Ig的1%，在个体发育中合成较晚。IgD铰链区很长，且对蛋白酶水解敏感，因此IgD半衰期很短，仅2.8天。血清中IgD确切的免疫功能尚不清楚。在B细胞分化到成熟B细胞阶段，除了表达SmIgD，抗原刺激后表现为免疫耐受。成熟B细胞活化后或者活化后或者变成记忆B细胞时，SmIgD逐渐消失。）

按可见反应

按与抗原结合后是否出现可见反应，可将其分为：在介质参与下出现可见结合反应的完全抗体，即通常所说的抗体，以及不出现可见反应，但能阻抑抗原与其相应的完全抗体结合的不完全抗体。

按抗体来源

按抗体的来源，可将其分为天然抗体和免疫抗体。抗体就是免疫球蛋白，是改变了的球蛋白分子。由特异性抗原刺激产生，抗体的产生是由于抗原侵入人体后引起各种免疫细胞相互作用，使淋巴细胞中的B细胞分化增殖而形成浆细胞，浆细胞可产生分泌抗体。

按抗体发展

单克隆抗体的发展经历了四个阶段，分别为：鼠源性单克隆抗体、嵌合性单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人源单克隆抗体。

鼠源性单克隆抗体：鼠杂交瘤单克隆抗体主要是将来源于免疫接种过的小鼠的B 细胞与骨髓瘤细胞融合，继而筛选出既能无限增殖又能分泌抗体的鼠杂交融合细胞，进而进行筛选、抗体制备和抗体纯化。

嵌合性单克隆抗体：指用人的恒定区取代小鼠的恒定区，保留鼠单抗的可变区序列，形成一个人-鼠杂合的抗体。其研制程序快，可大幅度降低异源抗体的免疫原性，却几乎保持亲本鼠单抗全部的特异性和亲和力。另外，它还具有人抗体的效应功能，如补体固定、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC）等。

人源化单克隆抗体：利用现有的无数已详细分析过的小鼠抗体，取其与抗原直接接触的那段抗体片段（互补决定区，CDR）与人的抗体框架嫁接，经亲和力重塑，可维持其特异性和大部分的亲和力，同时几乎去除免疫原性和毒副作用。

全人源单克隆抗体：其抗体的可变区和恒定区都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。全人源抗体制备的相关技术主要有：人杂交瘤技术、EBV 转化 B 淋巴细胞技术、噬菌体显示技术（phage display）、转基因小鼠抗体制备技术（transgenic mouse）和单个B细胞抗体制备技术等。

由人源化和全人源抗体制备的人源化和全人源抗体药物因其具有高亲和力、高特异性、毒副作用小的特点，克服了动物源抗体及嵌合抗体的各种缺点，已经成为了治疗性抗体药物发展的必然趋势。

克隆抗体的制备

多克隆抗体的制备

抗原制备

动物免疫

血清采集与检测

多抗纯化与保存

单克隆抗体的制备

概述

B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤细胞的无限分裂的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力。将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠腹水内即可获得大量的高效、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。

过程

1）免疫脾细胞的制备 制备单克隆抗体的动物多采用纯系 Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。

2）骨髓瘤细胞的培养与筛选 在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。

3）细胞融合的关键：

1技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。

2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。

4）阳性克隆的筛选 应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有 RIA法、 ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。

5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。

动物免疫

细胞融合

克隆筛选

交杂瘤细胞的克隆化

腹水制备与单抗纯化

关于抗体制备的详细内容参见“中国免疫学实验网”。

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生物活性

（1）特异性结合抗原：抗体本身不能直接溶解或杀伤带有特异抗原的靶细胞，通常需要补体或吞噬细胞等共同发挥效应以清除病原微生物或导致病理损伤。然而，抗体可通过与病毒或毒素的特异性结合，直接发挥中和病毒的作用。

（2）激活补体：IgM、IgG1、IgG2和IgG3可通过经典途径激活补体，凝聚的IgA、IgG4和IgE可通过替代途径激活补体。

（3）结合细胞：不同类别的免疫球蛋白，可结合不同种的细胞，参与免疫应答。

（4）可通过胎盘及粘膜：免疫球蛋白G（IgG）能通过胎盘进入胎儿血流中，使胎儿形成自然被动免疫。免疫球蛋白A（IgA）可通过消化道及呼吸道粘膜，是粘膜局部抗感染免疫的主要因素。

（5）具有抗原性：抗体分子是一种蛋白质，也具有刺激机体产生免疫应答的性能。不同的免疫球蛋白分子，各具有不同的抗原性。

（6）抗体对理化因子的抵抗力与一般球蛋白相同：不耐热，60——70℃即被破坏。各种酶及能使蛋白质凝固变性的物质，均能破坏抗体的作用。抗体可被中性盐类沉淀。在生产上常可用硫酸铵或硫酸钠从免疫血清中沉淀出含有抗体的球蛋白，再经透析法将其纯化。

（7）通过与细胞Fc受体结合发挥多种生物效应

①调理作用

IgG、IgM的Fc段与吞噬细胞表面的FcγR、FcμR结合，增强其吞噬能力，通常将抗体促进吞噬细胞吞噬功能的作用称为抗体的调理作用 （opsonization）。

②发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用

基因重排

抗体的L链是由C、V、J三个基因簇编码的，H链由C、V、D、J四个基因簇编码的。V是编码可变区，有300个种类；D编码高变区，有15 —— 20个种类；J编码连接V、C的结合区，有4——5个种类；C编码恒定区，仅有一种。这些外显子通过多种多样的重排，所合成出的肽链，还要再进一步进行L和H链组合，这样最后生成的抗体种类就非常多了。抗体基因重排是发生在淋巴细胞分化的时候。

单克隆抗体

（monoclonal antibody，McAb）克隆选择学说：淋巴细胞在与抗原接触前就已经存在多种多样的与抗原专一性结合的受体，一种细胞带一种受体，进入机体的抗原选择性的结合其中的个别淋巴细胞，使之活化，增殖产生大量带有同样受体的细胞群，分泌同样的抗体。当抗原进入体内，在机体中就会诱导出针对不同抗原决定簇的多种抗体，如果要把这些抗体一一分开，用现有的生物化学或物理化学方法是根本办不到的。1975年科勒（Kohler）和米尔斯坦（Milstein）将小鼠免疫细胞与肿瘤细胞融合，培养出既能迅速生长无限繁殖又可分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。从而获得针对某一特殊抗原决定簇的单克隆抗体。1995年，Katherine Knight博士在美国芝加哥Loyola大学成功地从转基因兔中获得了骨髓瘤细胞（Plasmacytoma），开创了兔单克隆抗体技术。与鼠单抗相比，兔单抗具有：首先，兔抗血清通常含有高亲和力抗体，可以比鼠抗血清识别更多种类的表位；其次，兔单克隆抗体能够识别许多在小鼠中不产生免疫的抗原；第三，由于兔脾脏较大，可以更多进行的融合试验，使得高通量筛选融合成为可能。

对于单克隆抗体的观察及揭露生命的结构，各种专门配方的苏木精伊红 (H&E) 和特殊染色剂可使观察更加的精准。高品质的 H&E 呈现清晰的核细节和轮廓分明的 H&E 染色，标准化一张载玻片接一张载玻片的染色一致性。

多样性

抗体的异质性。抗体的组成极为复杂，是由成千上万、多种多样的免疫球蛋白（Ig）分子所组成。这些Ig分子在形状、大小、结构以及氨基酸的组成和排列上，既相似，又有差别。由于有差别，它们的电泳活性就有很大的变化。

因为抗体具有与抗原决定簇相对应的结合部位（抗原结合簇），所以抗体与抗原的结合具有特异性。另一方面，抗体本身是一种蛋白质，具有本身的氨基酸组成、排列和立体结构，对异种动物来说，它又是抗原。各类Ig都具有可用血清学方法检出的抗原特异性，它们表现出不同的血清学类型。Ig抗原的特异性有3种：①同种型特异性：同一种属所有个体共同具有的抗原特异性。人的Ig可分为5大类（IgM、IgG、IgA、IgD、IgE）、两个型（λ型和κ型）、以及若干亚类、亚型、群和亚群等。但是，抗体和抗原结合的特异性与抗体的类、亚类、型别等无关；②同种异型特异性：同一种属（如人）的某些个体共有的抗原决定簇。这是由遗传基因决定的，某些重链和轻链（κ）的恒定区内，有个别氨基酸发生置换而形成Gm、Am、Km各型；③独特型特异性：由单一B细胞克隆产生的Ig分子独有的抗原性。此决定簇在重链和轻链的可变区，特别是在可变区的超变区中。由于每一个体抗体形成细胞是由多克隆组成，所以独特型特异性为数极多。

任何一个正常人血清中的抗体都是含有成千上万的、多种多样的、具有各种独特型抗原性的免疫球蛋白分子混合物。κ链和 λ链可以和各类、各亚类配合。重链、轻链本身又有各种异型，每一克隆产生的Ig又具有自身的独特型。

抗体的多样性受 B细胞系统的遗传基因控制。肽链是由两个不同基因分别编码可变区或恒定区，恒定区的基因（C基因）是有限的，它虽然可以决定Ig分子的类别和亚类，为造成Ig分子多样性的原因之一，但是，造成免疫球蛋白分子多样性的主要原因却在于可变区的异质性，可变区是由V基因编码的，而V基因的数目仍不清楚。

对抗体多样性的遗传控制曾提出3种学说：①种系学说（又称胚系学说）：抗体形成细胞具有编码Ig分子的全部基因（即有限数量的C基因和未知数量的V基因，它是通过长期进化形成并通过生殖细胞从亲代传给子代。又称胚系学说；②体细胞突变学说：在生殖细胞内只继承了数量有限的V基因，Ig分子多样性的形成，是由于体细胞在发育过程中发生突变或基因重组，从而产生许多不同的 V基因。体细胞突变可能对Ig分子的多样性发生重要作用;③V区基因相互作用学说：Ig分子可变区是由V基因片段、J基因片段和D基因片段组成，V、D、J基因相互连接对Ig分子多样性的产生，是极为重要的。Ig的多样性不可能简单地归因于上述的某一学说，它可能与上述多种机制有关，也可能还与基因片段连接点上的连接多样性以及VL和VH链的不同配对有关。

多样性原因/n人血清中的抗体多种多样，B淋巴细胞可产生的抗体种类在108以上，可与众多不同抗原发生特异性结合。抗体多样性的原因主要有两方面：/n1．外源性因素环境中抗原种类甚多，每种大分子抗原又有多种抗原表位，每种抗原表位均可选择激活体内一个B细胞克隆，产生一种特异性抗体。/n2．内源性因素抗体多样性的另一个原因是由基因的结构及功能特征所决定的。编码人Ig重链及κ、λ型轻链的基因分别位于第14、2、22号染色体上。其中编码Ig重链的基因包括编码可变区的V、D、J及编码恒定区的C基因；编码Ig轻链的基因包括编码可变区的V、J及编码恒定区的C基因。每种基因片段是以多拷贝的形式存在，其中编码重链V区的VH、DH和JH的基因片段数分别为50、23和6个；编码K轻链V区的Vx和JK基因片段数分别为60和5个，编码入轻链V区的VX和J入基因片段数分别为30和7个。这些基因在胚系阶段以分隔的形式存在。在B细胞的分化发育过程中，这些基因片段发生重排和组合，从而产生数量巨大、能识别特异性抗原的BCR。每种具有特异性BCR的B细胞克隆可识别相应的抗原，产生一种特异性抗体。Ig基因重组是B细胞合成无数特异性抗体的主要原因。 [

功能

识别并特异性结合抗原

识别并特异性结合抗原是免疫球蛋白分子的主要功能，这种特异性主要是由免疫球蛋白V 区的空间构型所决定。免疫球蛋白分子有单体、二聚体和五聚体等几种所谓的体形式。只有1 个Y 形分子组成的Ig 称为单体，如IgG、IgD、IgE 等；由2个Y 分子组成的Ig 称为双体如血清型IgA 或分泌型IgA ；由5个Y 型分子组成的Ig是一个星状结构， 5个单体间由二硫键结合在一起，称为五体或五聚体。不同的体结合抗原表位的数目不同，如Ig单体可结合2个抗原表位，为双价；分泌型IgA为4价；五聚体IgM理论上为10价，但由于立体构型的空间位阻，一般只能结合5个抗原表位，故为5价。 抗体在体内与相应抗原特异结合，发挥免疫效应，清除病原微生物或导致免疫病理损伤。例如IgG 和IgA可中和外毒素，保护细胞免受毒素作用；病毒的中和抗体可阻止病毒吸附和穿入细胞从而阻止感染相应的靶细胞；分泌型IgA 可抑制细菌粘附到宿主细胞。B 细胞膜表面的IgM和IgD是B细胞识别抗原受体，能特异性识别抗原分子。抗体在体外与抗原结合引起各种抗原抗体反应。抗体与其他免疫球蛋白分子区别，就在于抗体能与相应抗原发生特异性结合，在体内导致生理或病理效应。抗体是靠其分子上的特殊的结合部位与抗原结合的。/n

激活补体

补体是动物血清中具有类似酶活性的一组蛋白质，具有潜在的免疫活性，激活后能表现出一系列的免疫生物活性，能够协同其它免疫物质直接杀伤靶细胞和加强细胞的免疫功能。IgM、IgG与相应抗原结合后，可通过经典途径活化补体。IgA和IgG不能激活补体经典途径，但其凝聚形式可通过旁路途径活化补体，继而由补体系统发挥抗体感染功能。激活补体：抗体与相应抗原结合后，借助暴露的补体结合点去激活补体系统、激发补体的溶菌、溶细胞等免疫作用。/n三、结合细胞表面的Fc受体（Bind Fc receptor on cell surface）/nIg可以通过与多种细胞表面均有的Ig Fc 段的受体结合并通过受体细胞发挥各种不同的作用。/n1、IgG、IgA等抗体的Fc 段与中性粒细胞、巨噬细胞上的IgG、Fc受体结合，从而增强吞噬细胞的吞噬作用。/n2、表达Fc受体的细胞通过识别抗体的Fc段直接杀伤被抗体包被的靶细胞。抗体的这种作用称为依赖抗体的细胞介导的细胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）。/n3、IgE的Fc段可与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的高亲和力受体结合，促使这些细胞合成和释放生物活性物质，引起介导型超敏反应。/n4、Ig可通过胎盘而达到胎儿的血液中，使新生儿自然被动免疫，在保护婴儿抵御感染中有重要作用。/n5、免疫球蛋白A（IgA）可通过消化道及呼吸道粘膜，是粘膜局部抗感染免疫的主要因素。/n

抗体规律

（1）初次反应产生抗体：当抗原第一次进入机体时，需经一定的潜伏期才能产生抗体，且抗体产生的量也不多，在体内维持的时间也较短。

（2）再次反应产生抗体：当相同抗原第二次进入机体后，开始时，由于原有抗体中的一部分与再次进入的抗原结合，可使原有抗体量略为降低。随后，抗体效价迅速大量增加，可比初次反应产生的多几倍到几十倍，在体内留存的时间亦较长。

（3）回忆反应产生抗体：由抗原刺激机体产生的抗体，经过一定时间后可逐渐消失。此时若再次接触抗原，可使已消失的抗体快速上升。如再次刺激机体的抗原与初次相同，则称为特异性回忆反应；若与初次反应不同，则称为非特异性回忆反应。非特异性回忆反应引起的抗体的上升是暂时性的，短时间内即很快下降。